Cerita dimulai saat pihak Umbrella Corporation dibawah pimpinan General Cain (Thomas Kretschmann) membuka kembali The Hive yang semapt ditutup akibat kontaminasi virus-T. Tanpa diduga, virus-T sudah menjangkiti semua yang ada di The Hive sehingga tidak menyisakan apapun. Akhirnya ketika The Hive dibuka, semua virus yang ada disana (bersama semua zombie dan monster-nya) langsung keluar dan menginfeksi seisi kota Raccoon.
Beberapa orang penting Umbrella seperti Dr. Ashford (Jarred Harris) dan anaknya Angie Ashford (Sophie Vavasseur) langsung diungsikan oleh pihak Umbrella. Ketika dalam perjalanan, mobil yang membawa Angie Ashford dari sekolah mengalami kecelakaan, dan Angie secara mengejutkan selamat. Dia pun kembali ke sekolahnya untuk bersembunyi.
Sementara itu, Jill Valentine (Sienna Guillory) yang diskors akibat penelitian anehnya tentang zombie di pengunungan Arklay, secara tiba-tiba kembali ke kantor polisi dan menembak semua zombie yang ada. Dan ia menyuruh semua yang ada di kantor polisi untuk meninggalkan kota karena kota sudah terkontaminasi virus-T.
Ditempat lain, Alice (Milla Jovovich) ‘dibangunkan’ dari tidurnya oleh General Cain. Begitu Alice bangun dan keluar dari rumah sakit, dia terkejut saat mengetahui kota sudah porak poranda.
Malam harinya, seluruh penduduk kota mencoba meninggalkan kota Raccoon. Salah seorang diantara mereka tampak sudah terinfeksi dan mengigit Sersan Peyton. Atas kejadian itu, General Cain menutup pintu keluar kota dan menyuruh semua warga untuk kembali ke rumah masing-masing. Saat itu, Jill bersama Peyton bertemu dengan seorang reporter bernama Terri Morales. Dan mereka mengungsi kesebuah gereja. Didalam gereja mereka bertemu dengan seorang pria dan tampak beberapa monster juga sudah masuk kedalam gereja. Saat Jill dan Peyton kehabisan peluru, datanglah Alice dan membunuh semua monster tersebut.
Dilain tempat, L.J. (Mike Epps) mencoba bertahan dengan caranya sendiri. Dia menemukan beberapa anggota S.T.A.R.S yang masih bertahan. Namun di laboratorium lapangan, General Cain mengaktifkan projeknya yang lain, yaitu Nemesis (Matthew G. Taylor) atau yang sebelumnya dikenal dengan nama Matt Addison (Eric Mabius). Nemesis lalu menghabisi semua anggota S.T.A.R.S yang tersisa kecuali L.J.
Sementara di jalanan utama kota Raccoon, Carlos Olivera (Oded Fehr) bersama temannya Nicholai Ginovaef (Zack Ward) dihubungi oleh Dr. Ashford untuk mencari anaknya Angie. Dan mereka mencarinya kesekolah.
Dilain tempat, Alice dan Jill juga mendapat tugas serupa, namun dengan iming-iming keluar dari kota Raccoon sebelum di hancurkan oleh bom nuklir. Di tengah jalan, Nemesis menemukan mereka dan membunuh Peyton. Jill bersama Terri lari, sementara Alice menghadapi Nemesis sendirian.
Jill kemudian memakai mobil bersama Terri dan pergi ke sekolah Angie. Di tengah jalan mereka bertemu L.J. dan mengajak dia bergabung untuk mencari anak itu. Setibanya disekolah, mereka berpencar. Nahas bagi Terri sebab dia malah menjadi santapan yang lezat untuk para zombie kecil. Sementara L.J. nyaris digigit zombie sebelum akhirnya diselamatkan Carlos.
Sementara itu Jill akhirnya dapat menemukan Angie. Dan mereka bertemu Nicholai. Nicholai akhirnya tewas saat mencoba mengendalikan anjing mutan, sambil menyuruh Angie dan Jill pergi.
Jill dan Angie tampaknya juga akan menjadi korban anjing mutan selanjutnya jika tidak datang pertolongan Alice. Alice yang saat itu sedang merokok langsung melempar puntungya setelah melihat Jill menyalakan gas kompor dan lari. Setelah ledakan, semua tokoh utama film ini bertemu. Namun Carlos sudah tampak kesakitan dan muntah setelah sempat digigit. Akhinya sambil pergi menuju helicopter dengan mobil, Alice mengobati Carlos dengan vaksin dan menjelaskan pada semuanya bahwa kejadian yang menimpa kota Raccoon ini adalah akibat ulah Umbrella Corporation.
Ketika mereka mendekati helikopter, General Cain tampaknya sudah siap untuk menyambut proyeknya, Alice. Semua anggota tim tersebut ditangkap kecuali Alice. Cain lalu menyuruh agar Alice berkelahi dengan Nemesis. Namun Alice menolak karena tahu Nemesis itu adalah Matt Addison, mantan sahabatnya ketika masih berwujud manusia.
Kemudian Carlos dan Jill berhasil melepaskan diri dan bertarung melawan prajurit Umbrella, demikian juga dengan Alice, dan (anehnya) Nemesis. Akhirnya Cain ditangkap dan dimintai penjelasan. Namun Alice akhirnya melempar Cain ke tanah dari helicopter, dan Cain akhirnya tewas dimakan oleh para zombie.
Tak lama kemudian, kota Raccoon hancur oleh bom nuklir, dan heli yang membawa tim Alice jatuh di pegunungan Arklay. Alice tewas dan dibawa oleh Dr. Issacs (Iain Glen) ke lab umbrella. Sementara Jill dan Carlos entah kemana.
Dua minggu kemudian, Alice dihidupkan kembali oleh Dr. Issac dan ditanya seputar hal-hal sederhana karena pikirannya yang lama sudah lenyap. Tanpa diduga oleh Dr. Issac, Alice mempu mengingat pengalamannya, dan akhirnya melawan Dr. Issac dan timnya.
Alice kemudian kabur dan dibawa oleh Jill, Carlos, L.J., dan Angie Ashford. Dan pada akhirnya mereka pergi entah kemana, dan film ini pun berakhir dengan gambar satelit milik Umbrella Corporation.